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Introduzione

Concentrazione delle microsfere

La concentrazione delle microsfere nell’analisi incide sulla velocità del sistema. Se si

esegue un kit basato su xMAP, seguire le istruzioni del foglietto illustrativo del kit o il

protocollo software fornito. Generalmente si consiglia di utilizzare da 2000 a 5000

microsfere per target, secondo l’analisi.

Misurazioni ripetitive delle microsfere xMAP

In un’analisi xMAP, il segnale reporter è il risultato dell’analisi. A causa delle piccole

dimensioni delle microsfere, la sospensione xMAP mostra una cinetica della reazione

vicina alla fase di soluzione. Ciò significa che ogni insieme di microsfere xMAP utilizzato

per un determinato saggio mostrerà una distribuzione statisticamente uniforme delle

molecole reporter legate alla superficie di ciascun microsfera. Durante l’acquisizione dei

dati, numerosi microsfere di ciascun insieme vengono analizzati e il software calcola la

mediana di tale insieme. Più microsfere sono analizzati in ciascun insieme, più tale

misurazione è affidabile. Se si esegue un kit basato su xMAP, seguire le istruzioni del

foglietto illustrativo del kit o il protocollo software fornito.

Classificazione e fluorocromi reporter

Ciascun insieme di microsfere xMAP è colorato internamente con due tinte di

classificazione o tre tinte per microsfere superiori a 100-plex. Il segnale di fluorescenza

di tali tinte consente la classificazione di ciascun insieme di microsfere. Poiché ciascun

microsfera viene analizzato singolarmente, anche se le microsfere sono mischiati in

analisi multiplex, possono essere comunque distinti dal proprio segnale di emissione.

Il segnale di fluorescenza delle molecole reporter legate alla superficie di ciascun insieme

di microsfere viene misurato e utilizzato per determinare i risultati di ciascun saggio in

un multiplex. Poiché ciascun microsfera viene analizzato singolarmente, è possibile

quantificare accuratamente i segnali reporter di ciascun insieme di microsfere.

La seguente tabella mostra i flourocromi reporter accettabili e le relative lunghezze d’onda

di eccitazione ed emissione.

Volume campione

I volumi o le dimensioni dei campioni variano in valori compresi tra 10 e 200 µl. Assicurarsi

che un po’ del campione rimanga nel pozzetto dopo l’aspirazione; circa 25 µl in più del

volume del campione. Questa quantità può variare in base al tipo di piastra utilizzata.

Dopo l’acquisizione, l’analizzatore Luminex lava le linee dei campioni dando luogo al

ritorno di circa 150µl di fluido guaina nel pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Assicurarsi

TABELLA 2. Lunghezze d’onda dei fluorocromi reporter

R-Ficoeritrina Alexa 532

Peso formula (Dalton) 240 000 470

Max assorbanza (nm) 480, 546, 565 531

Max estinzione (M-1 cm-1) 1 960 000 83 800

Max emissione (nm) 578 554

Efficienza quantica 0,82 0,8

1 2 ... 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 ... 183 184

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